表观遗传“时钟”预测动物的真实生物学年龄

他的时钟基于对称为甲基的化学标签的分析，这些化学标签像手镯上的护身符一样挂在 DNA 上，有助于控制基因活动。它们是表观遗传学（字面意思是“高于遗传学”）的产物，该领域研究未写入遗传密码的可遗传信息。十几年前，霍瓦斯和他的同事们开始应用他们的专业知识来制造时钟，首先是评估唾液中 DNA 的年龄，然后是确定血液、肝脏和其他单个组织的年龄。

许多生物学家起初持怀疑态度，因为时钟植根于统计数据，而不是对生物分子机制的理解。然而，时钟的准确性经受住了考验，并在生物医学界引起了轰动。科学家们开始在他们的研究中使用 Horvath 时钟来测量细胞的衰老，因为与实际年龄相比，时钟是身体状态和疾病风险的更好仲裁者。 “表观遗传时钟比任何其他生物标志物都更接近衰老的实际过程，”布莱根妇女医院和哈佛医学院研究癌症和衰老的生物化学家Vadim Gladyshev说。现在，时钟正在引导一些科学家重新思考他们对衰老及其与疾病的联系的看法。

“我现在有很多在乳腺癌方面工作的合作者，并且[正在]开始思考，’如果你有晚期生物老化，这是否也有助于乳腺癌？’”卡罗林斯卡研究所的分子流行病学家Sara Hägg说在瑞典斯德哥尔摩。她补充说，如果时钟可以有效地阐明如何阻止衰老过程引发与年龄相关的疾病，“我们不仅可以预防一种疾病，而且可以预防多种疾病。”

看到信号

在过去的几十年里，生物学研究人员一次又一次地认为衰老的时钟触手可及。例如，他们在 1960 年代早期了解到，在培养中生长的细胞不是永生的，而是在仅 40 到 60 轮复制后死亡，这表明细胞具有一种老化时钟。 1982 年，研究人员认为，当他们分离出端粒时，他们可能已经发现了时钟的机制，端粒是染色体末端的 DNA-蛋白质复合物，每次细胞分裂时都会缩短。当端粒变得非常短时，细胞就会死亡。

但端粒并没有成为一个老化的时钟。端粒长度与年龄和死亡率的相关性在人类中很弱，在其他一些物种中不存在。 “端粒[长度]实际上并不追踪年龄。它只是跟踪细胞增殖，”Altos Labs 的首席研究员Ken Raj说。

在这些染色的染色体中，它们末端的端粒结构呈现红色。由于端粒随着每一轮细胞分裂而变短，研究人员曾经认为端粒可能是细胞老化时钟的基础。

作为端粒长度的替代方案，Horvath 于 2009 年开始研究基于细胞活性基因的 RNA 转录本的时钟，这是定义细胞并使其发挥功能的蛋白质模板。在接下来的两年里，他试图让这种方法发挥作用，但无济于事：转录数据太嘈杂了。

但在 2010 年，霍瓦斯回应了加州大学洛杉矶分校一位同事的帮助请求。为了研究性取向和表观遗传学之间可能的联系，研究人员正在收集性取向不同的同卵双胞胎的唾液，假设他们唾液细胞中的 DNA 可能揭示了甲基化模式的一些一致差异。 Horvath 的孪生兄弟是同性恋；霍瓦特是异性恋。他们提供了他们的口水。

该研究的分析着眼于 DNA 中胞嘧啶碱基所在的位点，并检查了哪些位点被甲基化。 （胞嘧啶是甲基附着的唯一碱基。）最近引入的芯片实验室技术可以轻松测试每个细胞 DNA 中的数万个胞嘧啶位点。当这位同事需要一位统计学家来分析数据时，Horvath 自愿提供了他的服务。

他没有找到他们要找的东西。 “没有任何迹象表明同性恋，”霍瓦斯说。 “但是因为数据在我的电脑上，我说，让我看看衰老的影响，”因为研究中双胞胎的年龄跨越了几十年。

在那之前，霍瓦斯在他自己的研究中避开了表观遗传数据。甲基化模式与基因表达的关系是混乱而间接的，而且它似乎不太可能与衰老显示出太多有用的联系。但现在他掌握了这些表观遗传数据的意外收获，看起来似乎没有什么坏处。

Horvath 开始将甲基化模式与双胞胎的年龄相匹配。在任何一种唾液样本中——或来自任何组织的任何样本中——并不是所有的细胞都会显示出相同的甲基化模式。但是可以测量DNA中特定胞嘧啶甲基化的细胞比例。例如，在一个样本中，40% 的细胞可能在某个位置被甲基化；在另一种情况下，这个比例可能是 45% 或 60%。

令他惊讶的是，霍瓦特发现年龄与甲基化细胞比例之间存在很强的相关性，即使他只观察了 DNA 中的一个位点。查看更多位置可以提高准确性。

“这改变了我的一切，”他说。 “一旦我看到衰老的信号，它就让我大吃一惊。”

Horvath 建立了一个模型，该模型根据唾液样本中数百万个细胞中约 300 个胞嘧啶的甲基化状态预测一个人的年龄。 “你吐在杯子里，我们可以测量你的年龄，”他说。

很快他就建立了表观遗传时钟模型，用于评估血液、肝脏、大脑和其他各种组织的生物学年龄。首先，他测量了每个样本中特定位点甲基化的细胞比例。根据这些数据，他创建了描述每个位点甲基化细胞比例的组织图谱。

为了建立一个时钟，他向计算机输入了数千个表观遗传图谱以及每个组织的年龄。通过机器学习，计算机将年龄与甲基化模式联系起来。它还缩小了预测年龄所需的站点数量。然后，计算机在计算中加权每个位点甲基化的重要性，以创建最佳的年龄预测公式，Horvath 对一组已知年龄的单独样本进行了测试。

两年内，他将他们各自的组织老化时钟组合成一个“泛组织”时钟公式，并于 2013 年发表。泛组织时钟是“游戏规则的改变者”，哥伦比亚邮报的流行病学家丹尼尔贝尔斯基说公共卫生学院。该公式适用于任何和所有含有 DNA 的人体细胞。任何人都可以使用它——Horvath 将软件放到了互联网上。通过上传他们自己的甲基化数据，生物学家可以了解他们样本中的细胞花费了多少时间。

量化下降

Horvath 的泛组织时钟在预测实际年龄方面奇迹般地准确。它似乎也反映了实足年龄和生物学年龄之间重要的潜在差异。研究人员发现，当表观遗传时钟估计某人的年龄大于实际年龄时，该人面临更高的疾病和死亡风险。当时钟估计某人更年轻时，他们的风险就会降低。尽管表观遗传时钟是从实足年龄数据中得出的，但它的算法比年龄更能预测死亡率。

因此，在 2014 年末，Horvath 开始明确地追踪生物学年龄。他和他的同事，包括Morgan Levine （耶鲁大学的病理学研究员，最近加入 Altos Labs）和美国国家老龄化研究所的Luigi Ferrucci ，训练了一种综合测量算法，其中包括实际年龄以及九个血液的结果预测疾病和死亡的化学测试。这些数据来自全国健康和营养检查调查中超过 9,900 名成年人的血液。由此产生的时钟DNAm PhenoAge于 2018 年发布，它预测了总体死亡率以及心血管疾病、肺病、癌症和糖尿病的风险以及其他结果。一年后，Horvath 和加州大学洛杉矶分校的 Ake T. Lu 领导的团队发布了一个更精确的死亡时间预测指标GrimAge ，它研究了一个人的性别、实际年龄、吸烟史和血蛋白死亡率指标。

Belsky 及其同事于 2020 年推出并于今年早些时候更新的一种新工具，可用作老化的速度计。在创建他们的衰老速度生物标志物时，他们量化了四个年龄的 19 个器官功能标志物的变化率，将它们编译成一个单一的指数，并用甲基化对其进行建模。 “我们实际上正在量化与年龄相关的衰退和系统完整性的持续过程，”Belsky 说。他说，按照这种方法，那些衰老得更快的人死得更早，并补充说，它对死亡率的预测与 GrimAge 一样，并且可能更好地预测中风和痴呆症。

古老的问题

2017 年，保罗 G. 艾伦家庭基金会的代表在霍瓦斯的一次会谈后找到了他。他们喜欢他的工作，并建议他有远大的梦想，因为该基金会支持高风险的事业。他们说，找一个别人不会资助的项目。

Horvath 很快就提出了适用于所有脊椎动物的老化时钟。该提议通过了——这已经够古怪了——但是当霍瓦斯开始意识到它所涉及的重要性时，这个计划变成了一个对所有哺乳动物来说相对受限的时钟。

到 2021 年 1 月，Horvath 拥有来自 128 个哺乳动物物种的甲基化数据，他将自己的时钟发布在预印本服务器 biorxiv.org 上。 “相同的数学公式，相同的胞嘧啶用于小鼠、大鼠、狗或猪。我们可以测量所有这些物种的衰老，”Horvath 说。尽管如此，他还是在全球范围内寻找更多信息。

到去年夏末，Horvath 与津巴布韦哈拉雷Tikki Hywood 基金会的穿山甲专家 Darren Pietersen 取得了联系，为他提供了收集穿山甲和其他几种物种数据的用品。甚至没有人确切知道穿山甲的寿命。一些官方的说法是 15 到 20 年，但 Pietersen 认为至少有些类型的寿命更长。 “我们最近变老的一只动物大约 34 岁（尽管误差幅度相当大），”他写道。

根据提供的组织数据，Horvath 制作了一个穿山甲时钟，这是他收藏的又一个寿命计时器。 “你要猪钟，我有猪钟。我有袋鼠和大象的时钟，”霍瓦斯说。每个特定物种的时钟对于该领域的科学家来说都是一个福音。例如，大象研究人员想要大象钟，以便他们能够确定野生种群的年龄结构，以帮助保护工作。

但是一个融合了所有这些的时钟可以帮助回答一个更基本的问题：什么是衰老？一种观点是，你的身体会像鞋子一样老化，逐渐褪色和磨损。但是泛哺乳动物时钟的成功预测意味着某些东西也会导致细胞在特定的时间表上失败，这可能是因为发育基因在它们的工作完成时不会关闭。 “这表明了老化过程中的一种决定性因素，”时钟的 100 多名建造者之一拉吉说。

来自甲基化时钟的数据表明，衰老很早就开始了，远在身体分解之前。在2021 年的一篇论文中，Gladyshev 和他的同事描述了一种甲基化时钟，可以确定哺乳动物发育阶段的日期。他们发现，在小鼠的早期胚胎发育过程中，某种程度的恢复使胚胎的年龄回零。然后，生物老化迅速进行，尽管在此期间人类儿童可以说是变得更强壮，而不是更弱，并且人类的死亡率下降到大约 9 岁。 “这对我来说意义深远，因为它将衰老问题归结为一个与发展过程密不可分的过程，”拉吉说。

最近对裸鼹鼠（一种寿命长达 37 年的啮齿动物）的两项研究表明，这种动物在表观遗传上会衰老，尽管它的死亡几率不会随着实际年龄的增长而增加。 “我认为死亡率并不是衡量衰老的最佳指标，”领导其中一项研究的格拉迪雪夫说。 “衰老是活着不可避免的结果。”

当然，衰老仍然反映了经验、行为和环境的影响。例如，通过甲基化和其他标志物测量，吸烟和日晒可以加速它，而运动或低热量饮食可以阻止它。在去年 3 月发表的工作中，为土拨鼠量身定制的表观遗传时钟表明冬眠可以减缓衰老，上周发表的一篇论文表明蝙蝠也是如此。为恒河猴制作的时钟表明，2017 年飓风玛丽亚在波多黎各海岸附近的一个岛上的一群猴子中加速了衰老。

原罪

没有人完全知道时钟为什么会工作。一些但不是所有涉及的基因和分子途径已被确定，研究人员仍在研究甲基化模式如何影响细胞、组织和器官的行为和健康。 “这又回到了我所说的‘建筑的原罪’，”霍瓦斯说。 “它基于在某种程度上与生物学无关的[统计]回归模型。”

为了弥补这一罪过，Raj 和 Horvath 已经开始寻找表观遗传衰老的生物学相关性。他们最近发现，根据热量限制饮食对衰老的影响，身体用来感知其对营养物质需求的生化途径的扰动会减缓衰老。破坏线粒体的工作会加速它。该时钟还跟踪干细胞的成熟。作者在 2022年Nature Aging上的一篇论文中写道，如果这些过程在更深层次上相互关联，表观遗传时钟可能会揭示衰老的统一机制。

然而，这些统一的机制可能是什么，或者为什么甲基化状态如此好地跟踪衰老，还有待完全确定。 “我们真的不知道表观遗传时钟是否与衰老有因果关系，”Hägg 说。

西雅图华盛顿大学医学院研究衰老生物学的研究员Matt Kaeberlein说，即使是这样，表观遗传时钟也几乎可以肯定只测量衰老过程中发生的部分情况。 “他们是否真的测量了不止一个维度的生物学年龄还不清楚，”他说。 “这是问题的一部分——表观遗传年龄与生物学年龄的混淆。在我看来，这些并不等同。”

Raj 推测甲基化变化反映了细胞特性随着年龄的增长而丧失。身体中的所有细胞都具有相同的 DNA，因此使肝细胞成为肝细胞和使心脏细胞成为心脏细胞的是基因表达模式，表观遗传学控制着这种模式。 Raj 建议，随着甲基化的变化随着年龄的增长而积累，其中一些控制可能会丢失，取而代之的是应该关闭的重新出现的发育程序。

尽管甲基化时钟可能是目前最准确的生物年龄监测器，但一些研究表明仍有改进的空间。更精确的预测器可能会将可量化的细胞特性（例如蛋白质、代谢物或基因表达水平）与生理信号和脆弱指数结合起来。 “我们现在可以测量一个人的很多东西，”Hägg 说。 “你量化的这些东西越多，你就越能准确地捕捉到你的衰老。”

Hägg 警告说，甲基化时钟的临床用途也有限。人们可以从各种商业来源购买他们的生物学年龄读数，但结果不仅经常不一致，而且缺乏临床相关性，因为时钟是用于研究中的群体水平分析。 “它们不是为了在个人层面上进行预测而设计的，”她说。

即使有人确实改变了他们的生活方式，从而降低了这些生物钟所测量的生物学年龄，他们的寿命是否会更长或患病的风险更低？ “我们还不知道，”Kaeberlein 说。

Horvath 现在正在准备一篇关于他的泛哺乳动物时钟的论文，以提交给期刊。尽管他似乎已经达到了自己的目标，但他收藏的空白仍然困扰着他。今年 5 月，他与澳大利亚一家博物馆的高级策展人就从有袋动物身上获取组织进行了通信，这种动物是一种大部分时间都在地下度过的小型、大部分失明的生物。 “我们已经从 348 种哺乳动物中生成了数据，但我们还想添加更多数据，”他说。

当 Horvath 提出这个项目时，他开始分析 30 个物种，但很快 30 个变成了 50 个，然后是 100 个，然后是这个数字的三倍多。 “我需要调整自己的节奏，”他说，“因为我有这种收集更多东西的冲动。”